Condensador microscopio:
El condensador – diferentes tipos. Contraste en el microscopio
En el artículo anterior sobre el ocular, señalé que el ocular se encontraba normalmente de modo que su plano focal frontal coincidiera con el plano de imagen principal (PIP). El PIP se conjuga con la muestra en el conjunto de imágenes de los planos conjugados, por lo que es útil para medir las características de las muestras microscópicas.
De la misma manera, el plano focal frontal del condensador se conjuga con el plano focal posterior del objetivo (pero no la muestra) en el tren de iluminación de rayos. El condensador, por lo tanto, proporciona un lugar accesible donde podemos alterar o regular el contraste de la imagen mediante la manipulación de los rayos de luz iluminadores. Estos dos principios surgen del método de iluminación de Köhler, que se trató en la parte 3 de esta serie.
La función del condensador
El condensador cumple dos funciones en el microscopio. Proporciona un área de luz uniformemente iluminada en el campo de visión en el plano de la muestra e ilumina la apertura del objetivo uniformemente con luz de ángulo suficiente pero controlable. En segundo lugar, como se mencionó anteriormente, proporciona un medio para regular el contraste (Bradbury y Evennett, 1996). La forma más simple de condensador es el espejo cóncavo, pero esto no es útil para objetivos superiores a NA 0.2 o menos. Si su microscopio tiene un espejo y una fuente de luz remota, el lado plano del espejo debe usarse junto con cualquier condensador de subestampación instalado. Esto se debe a que, estrictamente hablando, el condensador debe recibir iluminación paralela y, por lo tanto, llevar esta luz a un foco en el plano focal posterior del condensador (donde se encuentra la muestra).
Tipos de condensador
El tipo de condensador más utilizado es el condensador Abbe para microscopía de campo claro (Figura 1a, 1b). Está construido con dos o tres lentes, y el objetivo de foco corto superior generalmente puede voltearse fuera de la trayectoria óptica (1a), o desenroscarse (1b), para llenar el campo de visión con objetivos de baja potencia. Este iluminador simple será suficiente para la mayoría de los tipos de microscopía. Originalmente fue diseñado para proporcionar rayos estrechos (o “lápices”) de luz oblicua desde una apertura situada excéntricamente en el plano focal frontal del condensador. La Figura 1c muestra un iluminador Abbe simple de dos lentes montado en un aparato de subestaciones que se podía girar y mover excéntricamente para proporcionar iluminación oblicua. La Figura 1d muestra un condensador de baja potencia diseñado para llenar por completo el gran campo de visión de los objetivos de muy bajo aumento.
Aunque se puede citar una apertura numérica para el condensador (a menudo 0,9 NA para condensadores secos y 1,4 NA máximo para tipos de inmersión en aceite), estas cifras no dan ninguna indicación de la NA para la cual los rayos iluminadores se corrijan por aberración esférica. En muchos condensadores simples, un cono sólido de luz para iluminación axial rara vez se corrige para la aberración esférica por encima de 0,45 NA. Para un trabajo de alta calidad y para resolver la estructura en el límite de resolución, los condensadores deben corregirse por aberraciones. Los condensadores totalmente corregidos, como los objetivos, contienen muchos elementos de lente y se pueden corregir casi en el mismo grado. El condensador acromático-aplanático (1e) se corrige para la aberración esférica y la aberración cromática, y se debe utilizar para el trabajo de la más alta calidad, y la fotomicrografía en color. Los condensadores aplanáticos solo se corrigen por aberración esférica.
Los llamados condensadores “universales” (Figura 2) son multifuncionales. Consisten en un disco giratorio que contiene una selección de diafragmas de apertura, filtros, topes de parche, placas de fase o prismas Wollaston para contraste de interferencia diferencial (DIC). Esta disposición permite cambiar de un método de contraste a otro de manera conveniente y fácil. El parche de parche oscuro generalmente solo funcionará hasta NA 0.5 o menos. Para usar con objetivos de mayor NA, se debe usar un condensador de suelo oscuro especialmente construido (Figura 3). Para detalles sobre su uso y otros métodos para mejorar el contraste, ver Bradbury y Evennett (1996).
Condensadores universales
Condensadores universales. La imagen central muestra la tapa superior eliminada, mostrando el disco giratorio donde se ubican los anillos de la fase de apertura, los prismas DIC, el parche de tierra oscura, los discos Rheinberg y los filtros de modulación Hoffman. La mayoría de los condensadores universales poseen un diafragma de apertura para el trabajo de campo brillante, varios anillos para el contraste de fase y un tope de tierra oscura para tierra oscura de baja potencia.
Microscopía de luz transmitida y reflejada
La disposición del microscopio de luz transmitida exige un condensador separado, ya que la luz se condensa primero en la muestra (donde la luz interactúa con la materia), y luego es recogida por el objetivo más a lo largo del eje óptico.
La situación en el microscopio de luz reflejada es diferente. Aquí, la trayectoria del rayo se pliega alrededor del eje de la muestra donde la luz se refleja desde su superficie. El objetivo actúa como su propio condensador, y la alineación del microscopio de luz reflejada se simplifica mucho (ver los diagramas de rayos en la parte 2 de esta serie). Sin embargo, es difícil acceder al plano focal posterior del objetivo (plano focal frontal cuando se utiliza como condensador), por lo que se utilizan lentes suplementarias para crear una posición en la que la imagen de los diafragmas y filtros se conjuguen con el plano focal posterior.
El sistema de luz incidente es muy útil para la microscopía de fluorescencia, principalmente porque la iluminación de la muestra es simple, es más eficiente (brinda imágenes más brillantes con grandes aumentos) y se permite la combinación con otros métodos de contraste mediante luz transmitida.
Este epi-condensador tiene dos tipos de objetivos de luz reflejada instalados en su revólver. El objetivo en uso está diseñado para la iluminación de suelo oscuro, mientras que los otros dos objetivos que se pueden ver para el campo brillante reflejan el trabajo de la luz. Los collares anchos alrededor de estos dos últimos objetivos permiten que el objetivo se centre en el eje óptico. La ‘D’ en la carcasa del epi-iluminador denota la inserción intercambiable que permite que la unidad se use para la iluminación de campo oscuro. Se puede cambiar por un espejo plano para microscopía de luz reflejada de campo brillante. El condensador de luz transmitida se ha eliminado de debajo del escenario.
Si el objetivo actúa como su propio condensador en microscopía de luz reflejada, ¿por qué los objetivos no se utilizan también para la iluminación en microscopía de luz transmitida? Además de la dificultad práctica de acceso al plano focal del objetivo posterior, es difícil utilizar objetivos para uso multifuncional, y el ángulo de iluminación no suele ser controlable (mediante un diafragma iris en el plano focal trasero del objetivo).
Principios básicos de mejora de contraste
Se requiere visibilidad suficiente, o contraste, para que podamos percibir los detalles en la imagen que nuestros microscopios resuelven. La selectividad es importante: necesitamos al menos algunas diferencias regionales dentro del objeto, y entre el objeto y el fondo, para discernir los detalles.
El contraste en la imagen se obtiene por tres medios, ya sea por separado o en combinación. Son:
- interacción espécimen-luz,
- manipulación de la iluminación, y
- manipulación del medio de grabación de imágenes.
La alteración del contraste en la parte (c) se puede lograr mediante el desarrollo fotográfico y / o la impresión, y también mediante el uso de contraste electrónico de video analógico o imágenes digitales. Sin embargo, el condensador es instrumental en las partes (a) y (b) para manipular el contraste y la visibilidad en la imagen. Se pueden encontrar más detalles de los aspectos teóricos y prácticos de las técnicas de contraste en microscopía óptica en Bradbury & Evennett, 1996 y Sanderson, 2002, 2000, 1998 y 1994. En pocas palabras, las formas más conocidas de generación de contraste son campo brillante, iluminación oblicua , tierra oscura y Rheinberg, contraste de fase y DIC. También es posible combinar estos métodos con diferentes formas de iluminación (por ejemplo, luz polarizada con Rheinberg, o contraste de fase mediante campo luminoso transmitido con fluorescencia incidente). Dado que la mejora de contraste está muy bajo el control del microscopista, no se puede enfatizar demasiado la importancia del uso adecuado del condensador.
El condensador debe enfocarse correctamente (ver la parte 3, configuración del microscopio para la iluminación de Köhler) para lograr la mejor calidad de imagen. Esto es cierto cualquiera que sea el método de mejora de contraste (campo brillante, fase, suelo oscuro). El efecto más obvio de un condensador desenfocado en microscopía de campo brillante es una pérdida significativa de potencia de resolución que, a su vez, produce una imagen “podrida” con halos de difracción alrededor de cada punto de la imagen. El mismo resultado ocurre si la lente superior (foco corto) se omite o se deja volteada cuando se usa un objetivo de alta potencia, y el plano focal posterior del objetivo no está completamente lleno de luz.
Cuando se intenta la microscopía de contraste de fase con un condensador enfocado incorrectamente, el anillo en el condensador a menudo no coincidirá con el diámetro del anillo de fase en el plano focal posterior del objetivo, y se pierde cualquier mejora de contraste. Los problemas al enfocar el condensador también pueden dar como resultado una microscopía de suelo oscuro pobre, si la imagen del parche no ocluye completamente la iluminación directa del objetivo. La siguiente parte de esta serie regresa al objetivo, y considera la longitud del tubo, y cómo determinar la distancia focal, el aumento, la apertura y otros parámetros de sus objetivos.