 a menudo se usa para medir la concentración de células o partículas que se encuentran dispersas, pero no disueltas, en un fluido.densidad optica){kind=link}
Densidad optica:
Un problema común para el laboratorio de microbiología es la determinación de comenzar la concentración del inóculo. Si la concentración de inóculo se determina por recubrimiento, el inóculo tiene varios días antes de su uso. Este ensayo describe el uso de la turbidez para estimar la concentración microbiana en una suspensión, usando como ejemplo la prueba de eficacia antimicrobiana.
Determinación de Inóculo para AET
La prueba de eficacia antimicrobiana compendial (AET) requiere la inoculación del producto con microorganismos a una concentración final de aproximadamente 106 CFU / ml. Aunque parece ser un punto menor, sirve para ilustrar algunas de las dificultades inherentes a las pruebas microbiológicas y la necesidad de microbiólogos experimentados y académicamente capacitados para dirigir el laboratorio.
Veamos la guía compendial. La instrucción de Pharm Eur (1) sobre la preparación del inóculo para los estados AET:
“Para cosechar los … cultivos, use un líquido de suspensión estéril … Agregue suficiente líquido de suspensión para reducir el recuento microbiano a aproximadamente 108 microorganismos por mililitro … Retire inmediatamente una muestra adecuada de cada suspensión y determine el número de unidades formadoras de colonias por mililitro en cada suspensión por recuento en placa o filtración por membrana (2.6.12). Este valor sirve para determinar el inóculo y la línea base para usar en la prueba. Las suspensiones se usarán inmediatamente “.
Hay, por supuesto, dos problemas con estas instrucciones. El primero es que se instruye al técnico para que use un inóculo de aproximadamente 108 microorganismos por mililitro y luego se le instruye que determine esto mediante el recuento en placa. Las unidades formadoras de colonias (CFU) y las células son dos medidas diferentes y esto inevitablemente generará dificultades ya que el desafortunado trabajador del laboratorio no puede garantizar el número de células en la suspensión, solo el número de CFU encontrado. Sin embargo, podemos aceptar la inexactitud científica ya que los números generalmente se resolverán. El problema más serio es la instrucción de usar el recuento de placa CFU para la determinación del inóculo para la prueba, y que la suspensión debe usarse inmediatamente. Esto francamente no se puede hacer. Si usa la suspensión de inmediato, los recuentos de placa no están disponibles, si usa los recuentos de placa para establecer el inóculo, entonces la suspensión tiene al menos un día.
Contraste estas instrucciones con las del USP (2) para el mismo ejercicio:
“Para cosechar los … cultivos, use solución salina estéril … Agregue suficiente … para obtener un recuento microbiano de aproximadamente 1 x 108 ufc por ml … [Nota: la estimación de la concentración de inóculo se puede realizar mediante mediciones turbidimétricas para los organismos de prueba. Refrigere la suspensión si no se usa dentro de las 2 horas].
Determine la cantidad de ufc por ml en cada suspensión … para confirmar la estimación inicial de ufc por ml. Este valor sirve para calibrar el tamaño del inóculo utilizado en la prueba “.
Estas instrucciones de USP tienen la ventaja de ser físicamente posibles de realizar, una ventaja obvia para el trabajador del laboratorio. Sin embargo, la medida turbidométrica de las células también es solo una aproximación de CFU. Por lo tanto, la instrucción de confirmar los números (después de la prueba en curso) con el recuento de placas es un control importante en la prueba.
Este artículo explorará la aproximación turbidométrica para el número de células y los controles importantes sobre el proceso, así como las posibles dificultades del método.
Teoría
Las técnicas de dispersión de la luz para controlar la concentración de cultivos puros tienen las enormes ventajas de ser rápidos y no destructivos. Sin embargo, no miden el número de células ni miden CFU. La dispersión de la luz está más estrechamente relacionada con el peso seco de las células (3).
La luz pasa a través de la suspensión de microorganismos y toda la luz que no se absorbe se vuelve a irradiar. Hay una cantidad significativa de física involucrada en esto, y los interesados son referidos a tratados ópticos, particularmente aquellos que discuten el Principio de Huygens (una buena opción es Dispersión de Luz por Partículas Pequeñas por H C Van De Hulst). Para nuestros propósitos, es suficiente decir que la luz que pasa a través de una suspensión de microorganismos está dispersa, y la cantidad de dispersión es una indicación de la biomasa presente en la suspensión. En luz visible, esto aparece “lechoso” o “nublado” para el ojo (3). De esto se desprende que si la concentración de partículas dispersantes se vuelve alta, entonces son posibles múltiples eventos de dispersión.
Métodos
Los estándares de McFarland se pueden usar para aproximar visualmente la concentración de células en una suspensión. La escala de McFarland representa concentraciones específicas de UFC / ml y está diseñada para ser utilizada para estimar las concentraciones de bacterias gram negativas, como E. coli. Tenga en cuenta que esta estimación se vuelve incierta con los organismos fuera del uso normal, ya que las diferentes especies de bacterias difieren en tamaño y masa, al igual que la levadura y el moho. El uso de este método requerirá calibración y validación.
Los estándares de McFarland generalmente están etiquetados de 0.5 a 10 y están llenos de suspensiones de sales de bario. (Nota: ahora también hay disponibles suspensiones de perlas de látex que extienden la vida útil del material). Los estándares se pueden hacer en el laboratorio preparando una solución al 1% de BaCl2 anhidro y una solución al 1% de H2SO4, mezclándolos en las proporciones enumeradas en la tabla. Deben almacenarse en la oscuridad, en un recipiente herméticamente cerrado a 20-25 ° C y deben ser estables durante aproximadamente 6 meses.
La ventaja del uso de estos estándares es que no se necesita tiempo ni equipo de incubación para estimar el número de bacterias. La desventaja es que hay cierta subjetividad involucrada en la interpretación de la turbidez, y que los números son válidos solo para aquellos microorganismos similares a E. coli. Además, los valores no están en el rango apropiado para el inóculo de AET y por lo tanto pueden requerirse diluciones adicionales.
Espectrofotómetro
El método del espectrofotómetro mide la turbidez directamente. El mejor caso (es decir, el más sensible) sería tener una ranura estrecha y un detector pequeño para que el detector solo vea la luz dispersa en la dirección de avance. Este instrumento daría lecturas de absorción aparente más grandes que otros instrumentos.
Como debería ser obvio, cada espectrofotómetro utilizado debe calibrarse de forma independiente para su uso en la estimación de concentraciones microbianas. No solo la absorción aparente se ve afectada por el ancho de la rendija del instrumento, la condición del filtro y el tamaño y condición del detector, sino que también cada vez que se cambia la lámpara, la calibración debe repetirse ya que las diferentes bombillas pueden variar en producción total
La correlación de la absorción con el peso seco es muy buena para las suspensiones diluidas de bacterias (5), y esta relación parece mantenerse independientemente del tamaño de la célula (aunque la relación de absorción con la CFU no). Sin embargo, en suspensiones más concentradas, esta correlación (absorción al peso seco) ya no se cumple. El rango de absorción lineal para CFU estimado es de alcance limitado y por esta razón el estudio de calibración debe demostrar el rango lineal de los valores de absorbancia frente a CFU y los valores relevantes.
Procedimiento
Como hay una variedad de instrumentos diferentes, no puede haber un solo procedimiento. En general, el espectrofotómetro se puede configurar a una longitud de onda de 420 – 660 nm. Esta longitud de onda debe estandarizarse y es posible que deba ajustarse específicamente al material que se está probando. Diferentes células vegetativas, esporas bacterianas y esporas de Aspergillus niger pueden no tener la misma longitud de onda de absorbancia máxima.
Es importante tener las células en estado fisiológico de crecimiento conocido. Es decir, como el tamaño de la celda varía con la fase de crecimiento (retraso, registro, papelería), la relación aproximada entre la absorbancia y la UFC también variará. Una práctica recomendada podría ser pasar una colonia bien aislada dos veces en cultivos nocturnos con vetas superficiales de la población refrigerada, cosechando el cultivo de crecimiento rápido del segundo paso para la preparación de células vegetativas. Esto también servirá para minimizar una fuente de variabilidad para el AET (6).
Una segunda fuente de preocupación podría ser la cubeta utilizada para la medición: se debe tener cuidado para mantener la orientación correcta de la cubeta y protegerla de daños que podrían afectar el paso de la luz. Finalmente, es necesario en blanco el espectrofotómetro (ajuste la lectura de absorbancia a cero) usando un estándar, ya sea agua o el fluido de suspensión, y mantenga esta práctica.
Calibración
Debe recalcarse que esta calibración debe realizarse para todos los organismos. El tamaño del organismo, los pigmentos asociados, la preparación de la suspensión y otros factores influyen en las lecturas. Este estudio de calibración también debe volver a controlarse después de cambiar la bombilla de la fuente de luz, y se debe volver a evaluar a lo largo de la vida útil de la bombilla.
La calibración en sí es simple de realizar. Prepare una solución concentrada del organismo, cultivada en las condiciones que se utilizarán para la prueba. Realice una serie de diluciones para cubrir el rango de medidas de absorción de interés; Se recomiendan 5 a 8 diluciones. Inmediatamente tome las lecturas del espectrofotómetro en secuencia, y luego tome una lectura confirmatoria de la primera en serie para confirmar que no ha ocurrido crecimiento. Las diluciones se platean inmediatamente para el recuento viable (será necesaria la dilución en serie de las suspensiones). Grafica la relación entre la absorbancia y la UFC / mL después de que los recuentos de placa estén disponibles y usa valores en el rango lineal de este gráfico.