Funcion de la sal en la extraccion de adn:
El Protein Man dice:
Para identificar bacterias y virus en una muestra ambiental, diagnosticar patologías de la enfermedad o examinar una muestra biológica para fines forenses, el ADN se puede eliminar del núcleo de una célula y sus proteínas se pueden separar por electroforesis. La sal, el isopropanol y el etanol se usan comúnmente para precipitar el ADN.
extracción de ADN, etanol, isopropanol, extracción de ADN de la sangre y otros tejidos celulares: fase inicial
El proceso de extracción de ADN comienza con la separación mecánica de los contenidos nucleares del resto de la célula, que se lleva a cabo mediante sonicación, agitación y la adición de detergentes SDS. Para descomponer aún más los componentes celulares y luego extraer las proteínas asociadas al ADN, los investigadores suelen agregar amonio, acetato de sodio o sales similares durante esta etapa del procedimiento.
Extracción de ADN con precipitación de etanol
Dado que el ADN es insoluble en etanol e isopropanol, la adición de alcohol, seguido de la centrifugación, hará que las proteínas de ADN salgan de la solución. Cuando la concentración de ADN en la muestra es alta, la adición de etanol provocará la formación inmediata de un precipitado blanco. Si la concentración de ADN en la muestra es baja, el isopropanol puede funcionar mejor que el etanol para precipitar las proteínas disponibles. Además, el isopropanol se usa a menudo para precipitar ADN de grandes volúmenes ya que se usa menos alcohol (ver protocolos a continuación).
El etanol y el isopropanol también pueden lavar el resto de sal restante. Después de lavarse en alcohol y someterse a una centrífuga, la proteína de ADN precipitada formará un sedimento, que puede lavarse nuevamente en alcohol, secarse y resuspenderse en un tampón Tris o TE. Tenga cuidado de no excederse en la muestra, ya que esto puede desnaturalizar el ADN; simplemente deje la bolita lavada en la mesa de laboratorio por unos minutos. Si se usó isopropanol durante la extracción en lugar de etanol, la muestra puede no adherirse tan fuertemente al tubo y puede requerir un tiempo de secado más prolongado.
Protocolo general para la precipitación de etanol
Agregue 1/10 del volumen total de acetato de sodio (3M, pH 5.2).
Agregue 2-3 veces el volumen de al menos 95% de etanol. Calcule después de la adición de acetato de sodio.
Incubar en hielo durante 15 minutos. En el caso de pequeños fragmentos de ADN o altas diluciones durante la noche la incubación da mejores resultados.
Centrifugar a> 14,000 x g durante 30 minutos a 4 ° C para evitar el sobrecalentamiento de la muestra.
Deseche el sobrenadante mediante decantación o pipeteo, teniendo cuidado de no tirar el sedimento de ADN que puede o no ser visible.
Enjuague con etanol al 70% y centrifugue a> 14,000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente o 4 ° C.
Desechar el sobrenadante, secar al aire el sedimento (5-20 minutos) y disolver el sedimento en el tampón deseado.
Protocolo general para la precipitación de isopropanol
Agregue 1/10 del volumen total de acetato de sodio (3M, pH 5.2).
Agregue 0.6-0.7X volumen de isopropanol a temperatura ambiente. Calcule después de la adición de acetato de sodio. La temperatura ambiente del isopropanol minimiza la coprecipitación de la sal.
Inmediatamente, centrifugue a> 14,000 x g durante 30 minutos a 4 ° C para evitar el sobrecalentamiento de la muestra.
Deseche el sobrenadante mediante decantación, teniendo cuidado de no tirar el sedimento de ADN que puede o no ser visible. Los gránulos precipitados con isopropanol a menudo son difíciles de ver y están flojos. Marque fuera del tubo antes de la centrifugación para una fácil identificación.
Enjuague con etanol al 70% y centrifugue a> 14,000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente o 4 ° C.
Desechar el sobrenadante, secar al aire el sedimento (5-20 minutos) y disolver el sedimento en el tampón deseado.